弯曲杆菌是引起食源性感染的主要细菌原因，是从环境来源（如湖泊、河流、海洋和污水）中分离出来的，这表明环境水是将弯曲杆菌传播给人类的可能载体。然而，分离与水传播暴发有关的弯曲杆菌似乎具有挑战性，这不仅是由于从环境和粪便样本中分离出来的弯曲杆菌的可培养能力迅速丧失，也由于最初的感染和暴发调查之间的时间间隔。因此，采用基于培养的方法对水资源进行定期监测系统可能会低估弯曲杆菌在环境中的流行率，这可能会误导我们对环境源在人类感染中所发挥的作用的理解和弯曲杆菌对食物链的污染的可能。为此推荐本篇文章与大家一起学习，希望能对大家有所帮助。

内容

1.摘要

空肠弯曲杆菌是世界范围内主要的食源性致病菌之一，广泛存在于多种食物、家畜、野生动物和环境中。目前可用的基于培养的分离方法对废水样品不是很有效，因为在竞争细菌中空肠梭菌的数量很少。为了从废水样品中检测和分离空肠弯曲杆菌，本研究使用五种不同的抗生素（如头孢哌酮、万古霉素、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素B和利福平）评估了几种不同的富集条件，空肠弯曲杆菌对此具有内在耐药性。用qRT-PCR检测Ct值测定各富集条件的选择性和多重PCR检测弯曲杆菌的种类。此外，通过在Bolton和Preston 琼脂平板上生长来考察弯曲杆菌在不同培养基上选择性富集后的分离效果。在Bolton选择性补充剂中添加多粘菌素 B、利福平或两者均可增强空肠弯曲杆菌的选择性分离，16S rDNA测序结果显示，肠球菌属和铜绿假单胞菌是富集条件下的主要竞争细菌。虽然已知很难从重污染的样品中分离出弯曲杆菌，但本研究很好地表明，抗生素选择的处理可以提高从废水中分离苛养型的弯曲杆菌的效率。

2. 结果与讨论

空肠弯曲杆菌在不同抗生素补充剂下的生长：

Bolton选择性补充剂（BN）由三种抗生素组成，包括头孢哌酮、万古霉素和甲氧苄啶，在实验中，BN作为基础抗菌补充剂，在BN中添加多粘菌素B、利福平或两者以增加抗生素选择压力。

    在BN中加入多粘菌素B或利福平均不影响生长。在12 h时，同时添加利福平和多粘菌素B可略微降低OD₆₀₀；然而，在四种不同的富集条件下，生长没有显著差异(图1)。结果表明，空肠弯曲杆菌可以在天然耐药的多种抗生素联合存在的情况下生长。

不同富集条件下qRT-PCR检测弯曲杆菌的Ct值:

      qRT-PCR检测弯曲杆菌的Ct值随抗菌富集程度的不同而变化。添加一种抗生素(即利福平或多粘菌素B)显著降低了Ct值，说明弯曲杆菌的数量因选择性富集而增加。此外，与其他富集条件相比，添加两种抗生素的Ct值最低(图2)，表明抗生素选择压力的增加增强了原始污水样品中弯曲杆菌的富集。

不同富集条件下弯曲杆菌的多重PCR检测：

TABLE 1 | The number of positive detection of Campylobacter 16S rDNA,

C. jejuni, C. coli, and C. lari with multiplex PCR in four different enrichment conditions at 42◦C.

    多重PCR结果显示，原发弯曲杆菌属为空肠弯曲杆菌和大肠杆菌(表1)。与多粘菌素b相比，添加利福平检测空肠弯曲杆菌和大肠杆菌的频率更高。

增加抗生素选择压力来增强从原始污水中分离出的弯曲杆菌：

    为了检查琼脂培养基对弯曲杆菌分离的影响，我们将富集培养物接种在弯曲杆菌的常见培养基 Bolton 和 Preston 琼脂上。与qRT-PCR结果一致，添加利福平、多粘菌素B和两种抗生素可显著提高弯曲杆菌的分离频率，降低非弯曲杆菌的分离频率（图3）。其中，BNRP对弯曲杆菌的分离率最高，而BN没有恢复任何弯曲杆菌。

    虽然抗生素富集显着影响分离频率，但 Bolton 和 Preston 琼脂培养基在分离频率上没有任何差异。

    为了鉴定在选择性富集培养基上生长的主要非弯曲杆菌群体，我们根据菌落形态随机选择了100个菌落，并进行了16S rDNA扩增子测序。主要的非弯曲杆菌属包括肠球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、变形杆菌和假单胞菌（表2）。补充额外的抗生素，无论是单一的(即BNR和BNP)还是两者(即BNPR)，都抑制了其他细菌种群的生长，然而，在BNPR中仍然分离到肠球菌。重要的是，增加了抗生素的选择压力提高了从废水中分离出弯曲杆菌的频率。

讨论：

    研究发现增加抗生素选择压力和培养温度是影响影响从严重污染废水样品中成功分离空肠衣原体的关键参数。此外，利福平似乎可以有效地提高基于PCR的定量方法中弯曲杆菌富集的选择性，而利福平和多粘菌素B都需要抑制竞争性细菌的生长，并通过基于培养的方法提高对空肠弯曲杆菌分离的选择性。