洋葱伯克霍尔德氏菌复合体（BCC）能够在低营养环境和恶劣条件下保持存活，对非无菌药品构成污染风险，且难以检测。BCC分离株是污染无菌和非无菌药品的一些最常见的微生物，最近爆发的几次感染与被发现的含有BCC的防腐剂有关。含水产品尤其危险，因为BCC能够在恶劣条件下保持活力，包括防腐剂的存在。本研究的目的是评估使用寡营养培养基的BCC，与使用TSA或TSB在不同的无菌蒸馏水样品中保存温度以及不同的防腐剂浓度下的恢复情况，并进行比较。因此推荐这篇文章给大家，希望能对大家有所帮助。

Oligotrophic Media Compared with a Tryptic Soy Agar or Broth for the Recovery of Burkholderia cepacia Complex from Different Storage Temperatures and Culture Conditions

内容

摘要：洋葱伯克霍尔德氏菌菌群（BCC）能够在低营养环境和恶劣条件下保持存活，对非无菌药品构成污染风险，并对检测构成挑战。为了建立检测BCC的最佳回收方法，我们对三种寡营养培养基进行了评价，并用营养培养基从高压蒸馏水或防腐溶液中回收BCC进行了比较。将20株BCC菌株连续稀释后（10^-1~10^-12 CFU/ml）接种到高压蒸馏水中，在6℃、23℃和42℃条件下保存42天。用6种洋葱伯克霍尔德氏菌悬液接种含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯铵（BZK）的水溶液，并在23℃再储存199天。营养培养基，如胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），少营养培养基(1/10强度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3强度R2A或R2AB，使用这些培养基接种从高压蒸馏水和防腐样品的BCC。液体培养基中BCC（水中或防腐剂中）的回收率高于固体培养基。寡营养培养基对20株BCC样品的回收效率高于TSA或TSB。多重比较的结果使我们能够直接识别TSA或TSB与寡营养培养基之间的显著差异。美国药典（USP）提出的BCC检测的简单检测方法提供了一种寡营养培养基预富集复苏步骤。

材料和方法：

寡培养基的制备：

结果：

不同储存温度下TSB和R2AB的生长动力学：为了了解温度对存活的影响，将20株BCC在3种温度（6℃、23℃和42℃）下保存42天，并在不同的培养基中恢复。综合结果，在6℃、23℃和42℃下观察到存活，没有发现物种特异性的趋势。当培养基接种初始浓度为10²-10⁰ CFU/ml（在蒸馏水6℃和23℃保存42天），10⁸-10⁶ CFU/ml（在蒸馏水42°C保存42天时），观察到洋葱AU19236的生长。在TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB中观察了AU19236在30℃培养24 h后的生长，并使用Baranyi模型描述了动力学。接种TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的AU19236拟合的生长曲线平均r²值为> 0.98。由于回归线与观测数据点近似，因此在平均生长曲线中得到了较高的r²值。在6℃保存的蒸馏水中培养，显示出更长的滞后时间（λ），范围在17.6-27.4h之间（图1A）。在23℃和42℃（分别为10.1和14.2h）下估计的滞后时间没有显著差异（1B和1C）。在6℃和23℃时，1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的滞后时间值（λ）大于TSB，但在42℃时，滞后时间值不大。此外，无论使用何种培养基生长速度(μ)没有显著差异（p > 0.05），尽管寡营养的生长培养基（如1/10×TSB,R2AB和1/3×R2AB在23℃和42℃）增长率更大。

不同储存温度下TSA与寡营养固体培养基比较：为了评估固体培养基中的活菌落计数，使用ProtoCOL3自动平板计数器对每个平板进行计数。

经过42天的培养，在6°C（10⁴-10⁸ CFU/ml）和23°C（10⁷-10¹² CFU/ml）的浓度下，所有的琼脂都很容易恢复。然而，在42°C（10²-10⁶ CFU/ml）的蒸馏水中当20株BCC菌株被接种在固体培养基上时，只有8株BCC菌株42天后生长。其余菌株培养9天后没有在固体培养基上生长。

在6°C储存42天后，所有琼脂的回收率约为10⁴ -10⁸ CFU/ml。B. lata HI4002，B. cenocepacia HI2976 和 B. cenocepacia HI2485 为BCC菌株，菌落计数较高，达到10⁸ CFU/ml。1/3×R2A（1.79 ± 6.81×10⁸ CFU/ml）和R2A（1.95 ± 7.31×10⁸ CFU/ml）的菌落计数略高于TSA（1.67 ± 6.41×10⁸ CFU/ml）的菌落计数。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比较TSA与1/10×TSA、1/3×R2A和R2A之间的差异，差异无统计学意义（p < 0.05）。在23°C的蒸馏水中，在各种培养基上，10¹² CFU/ml BCC的初始浓度保持不变。1/10×TSA（4.18 ± 6.17×10¹² CFU/ml）、1/13×R2A（4.17 ± 5.62×10¹² CFU/ml）和R2A（4.46 ± 5.78×10¹² CFU/ml）的菌落计数均高于TSA（3.44 ± 5.09×10¹² CFU/ml）。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比较TSA与R2A的差异，发现差异有统计学意义（p < 0.041）。

在42°C时，只有8株菌株生长到约10⁵ CFU/ml。1/10×TSA（2.01 ± 4.17×10⁵ CFU/ml）、1/3×R2A（6.56 ± 15.05×10⁵ CFU/ml）和R2A（6.53 ± 14.72×10⁵ CFU/ml）的菌落数量比TSA（0.57±1.39±1.39×10⁵ CFU/ml）更高。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比较TSA与寡营养培养基的差异，如1/10×TSA（p = 0.008）、1/3×R2A（p < 0.001）和R2A（p < 0.001）。

不同储存温度下TSB和寡营养肉汤培养基的比较：对TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉汤培养基在6°C、23°C和42°C下恢复BCC的能力进行了评估。

     在6°C存储时，与1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB相比，TSB介质中的回收效率较低，回收率分别为351/480（回收次数/测试次数）、345/480和353/480。对接种的菌落数最低（10^-12）的4个肉汤的评价表明，1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB支持从23°C存储中回收BCC。在480次试验中，分别有39、94、94、107、79个TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB培养基中BCC的回收率存在差异。统计分析显示，TSB的有效性低于1/10×TSB。

CHX和BZK的恢复

TSA和稀释固体培养基在不同浓度的防腐剂下的比较：将6株菌株悬浮在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中。在5和50 μg/ml的CHX溶液中，1/10×TSA（7.06 ± 6.5×10⁴ CFU/ml，3.73 ± 3.93×10³ CFU/ml）的菌落计数略高于TSA（6.59 ± 5.12×10⁴ CFU/ml，3.03 ± 3.42×10³ CFU/ml），分别如下图：

    采用Mann-Whitney Rank Sum Test比较TSA与1/10×TSA的差异，两组间差异无统计学意义(p < 0.05)。此外，在10 μg/mlBZK溶液中，1/10×TSA（1.51 ± 1.77×103 CFU/ml）、1/3×R2A（1.58 ± 1.73×103 CFU/ml）、R2A（129±2.24×103 CFU/ml）的菌株数量分别略高于TSA（1.27 ± 1.28×103 CFU/ml）。

不同浓度防腐剂下TSB和少营养肉汤培养基的比较：对TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉汤培养基在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中恢复BCC的能力进行评价。在R2AB介质中恢复效率更高，恢复数量分别为134/144（恢复次数/试验次数，从5 μg/ml of CHX）、114/144（50 μg/ml of CHX）和113/144（10 μg/ml of BZK）。

    数据统计分析显示，TSB和R2AB的CHX的5μg/ml（χ2统计= 6.9231，p = 0.0085）、50 μg/ml的CHX（χ2统计= 9.8223，p = 0.0017）和10 μg/ml的BZK（χ2统计= 31.3481，p < 0.05）之间存在显著差异。

讨论：

洋葱伯克霍尔德氏菌复合体（BCC）能够在低营养环境和恶劣条件下保持存活，对非无菌药品构成污染风险，并对检测构成挑战。为了建立检测BCC的最佳回收方法，作者对三种寡营养培养基进行了评价，并与营养培养基从高压蒸馏水或防腐溶液中回收BCC进行了比较。将20株BCC菌株连续稀释后（10^-1~10-¹² CFU/ml）接种到高压蒸馏水中，在6℃、23℃和42℃条件下保存42天。用6种洋葱伯克霍尔德氏菌悬液接种含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯铵（BZK）的水溶液，并在23℃再储存199天。营养培养基，如胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），少营养培养基(1/10强度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3强度R2A或R2AB)通过接种高压蒸馏水和防腐样品的BCC到培养基中。肉汤培养基中水中或防腐剂中BCC的回收率高于固体培养基。寡营养培养基对20BCC样品的回收效率高于TSA或TSB。多重比较的结果使我们能够直接识别TSA或TSB与寡营养培养基之间的显著差异。