浸没培养后孢子形成条件对萎缩芽孢杆菌孢子抗H2O2 灭活能力的影响

在食品和制药行业，生产和包装中的无菌性在许多情况下极为重要。芽孢由于其高抵抗力，可以在巴氏灭菌和不充分的灭菌过程中存活下来，然后发芽，从而污染装入非无菌容器中的无菌产品。因此，生产设施的无菌性和无菌生产的所有灭菌方法均经过初步验证，定期使用所谓的生物指标（BI）进行测试。这些生物指示测试菌，对相应的灭菌过程具有明确的抵抗力。但对某些灭活方法（例如使用 H₂O₂）具有很高的抵抗力，而且市售BI的抵抗力差异很大。为此推荐本篇文章与大家一起学习，希望能对大家有所帮助。

内容

1.摘要

孢子的抗性形成，尤其是萎缩芽孢杆菌的抗性形成，长期以来一直是生物防御、制药和食品工业科学研究的重点。在食品工业中，它被用作生物指示剂 (BI)，用于评估过氧化氢在加工和最终包装线灭菌中的灭活效果。尽管用作生物指示剂的孢子已经生产多年，但人们对孢子形成条件对抗性的影响知之甚少，而孢子形成条件是随机变异的潜在来源。因此，本研究考察了在生物反应器中浸没生产过程中孢子抗性对温度、pH 值和部分氧饱和度的依赖性。为此，在不同的孢子形成条件下生产孢子，并使用35%液态过氧化氢中的计数减少测试确定它们的抗性（由D值定义）。测试结果的统计分析表明，抗性与pH值呈二次依赖关系，中性pH下的D值最高。孢子形成温度对抗性具有线性影响，温度越高，D值越高。但是，这些因素相互作用，这意味着当pH值在一定范围内时，温度才会影响抗性。孢子形成过程中的氧饱和度没有显著影响。根据获得的数据，可以开发一个模型，根据孢子形成条件来计算、预测和标准化BI的抗性。为此，BI制造商可以生产具有明确抗性的BI，以验证无菌包装/灌装线中的灭菌效果，从而可靠地生产保质期长且安全的食品。

2.结果与讨论

为了能够研究孢子形成条件（pH、温度、培养基中的氧饱和度）对孢子抗性的影响，开发了全因子实验设计（DoE）。通过因子测试计划，可以检查多个因素对一个（或多个）目标变量的影响。本研究中的影响变量为温度、pH 值和培养基的氧饱和度。对于有 2-3 个影响因素的情况，通常采用两阶段测试计划，即每个影响变量都在两个层面上进行检验（最小值和最大值）。

为了进行建模，在生物反应器中进行了初步测试以确定极值。极值设置为pH 6.0和8.5，中心点为7.25；对于温度，它们被设置为 28 ℃ 和 40 ℃，中心点为 34℃；对于最低氧饱和度，它们被设置为10%、60% 和 35%。根据这个值范围确定实验计划，并在指定的孢子形成条件下在生物反应器中产生孢子。收获并纯化产生的孢子后，以 25 ℃下对35%液态过氧化氢的D值来确定孢子的抗性。

表1显示了具有孢子形成条件的全因子实验设计以及由此产生的测量和计算的D值。可以看出，测试系列的测量D值与调整后的模型的计算D值非常匹配。实验编号9是一个例外，这就是为什么它没有被包括在计算中。

       16次测试系列的测量D值在40到197秒之间，与模型计算出的D值非常吻合。这可以通过在图1中绘制测量的D值与计算出的D值来证实，r² 值为 0.93。模型对齐还表明，培养基中的氧饱和度对D值没有显着影响。

因此，在进一步的模型计算中不考虑氧饱和度。

    根据D值，该模型得出一个方程（方程1），通过该方程可以预测模型范围内的所有D值（如在极端情况下的影响因素温度和pH值）。

利用该方程可以建立D值对温度和pH值影响的三维预测模型（图2）。

在pH为6.9和温度为40℃时，D值最高，为 200 s。预期D值会随着pH值的酸碱变化而下降。根据所选的pH值，温度对D值的影响也不同。在pH值较低（例如6.0）时，D值对温度呈现出非常强的线性依赖性，这意味着随着温度的升高，D 值也会增加。在pH 值为8.5时，升高温度不会增加D值。这两个影响变量之间的相互作用在图3中变得明显。

随着pH值的增加，温度的影响逐渐减小，温度对D值的最大影响是在pH值6.0的微酸性条件下，当pH达到7.0 时，温度对D值的影响会减弱，但仍然很大。从pH值7.8到8.5，温度对D值不再有显著影响。此外，pH对D值的影响也会根据温度而变化。在28℃ 时，预期 pH 值为7.2时D值最高。在40℃时，预期pH 值为6.9 时D值最高。这意味着预期最大D值的pH值会随着温度升高而变化。

本研究表明，浸没式生产的孢子对过氧化氢的抗性在很大程度上取决于 pH 值和温度。pH 值对抗性有二次影响，这意味着存在一个最佳值，在该最佳值下抗性达到最大值。如果 pH 值进一步变为酸性或碱性，孢子的抗性也会降低。然而，抗性对温度呈线性依赖性。随着温度升高，孢子对过氧化氢的抗性也会增加。应该注意的是，pH值和温度之间存在相互作用，这意味着这些因素相互影响。在pH值中性和酸性范围内，温度的影响最强。当pH值变得更碱性时，温度的影响会降低，直到温度最终对抵抗力没有影响。培养基的氧饱和度对孢子的抗性没有显著影响。

本研究未研究温度和pH值与培养基或其成分（主要成分、浓度和锰、铁、锌、钙等的存在）之间是否存在相互作用以及相互作用的程度，以及这是否会影响孢子对过氧化氢的抗性。孢子抗性的形成受到许多因素的影响，这些因素相互交织、相互影响或相互依赖。因此，未来不应再单独或仅以最谨慎的态度来研究这些影响因素。