细菌孢子在环境中普遍存在，本质上能够抵抗许多极端条件，包括高温、有毒化学物质、辐射等，这给生产无菌药品的制药设施带来了重大挑战。进行环境监测和消毒是确保设施处于无菌控制状态的两种常见方式，但杀孢子活性很容易受到多种因素的影响，包括消毒剂浓度、细菌种类、载体表面、接触时间和干扰物质。由于孢子质量低、中和方法无效、接触时间不准确等原因，可能会观察到假阳性的杀孢子结果。在这方面，需要一种标准化的方法来验证药物配制设施中消毒剂的有效性，特别是针对高品质芽孢杆菌孢子的滴度、纯度和抗性。为此推荐本篇文章与大家一起学习，希望能对大家有所帮助。

内容

1.摘要

验证杀孢子剂的功效是当前良好消毒生产规范中的关键步骤，孢子质量差会导致杀孢子结果呈假阳性。本研究旨在探索芽孢杆菌孢子的最佳孢子形成和纯化方法。在5种不同的孢子形成培养基中产生了7株芽孢杆菌的孢子，密度离心后，用相差显微镜和计数分析法测量孢子的产量。通过次氯酸钠杀孢子试验确定了加热、超声处理和溶菌酶等纯化方法以及成熟对孢子质量的影响。在所测试的7种芽孢杆菌菌株中，有4种认为DSM是其首选孢子形成培养基。蜡状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在30°C下的孢子形成率高于在37°C下的孢子形成率，地衣芽孢杆菌在 37°C下于MAC中，其孢子形成率比其他培养基高出40-72%。在2xSG中观察到了蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌形成最大孢子量。所有研究的纯化方法都提高了孢子的纯度，并随着菌株的变化而变化。然而，高温（80°C，持续20 min）和溶菌酶（100 μg/mL）处理会使特定芽孢杆菌菌株对次氯酸钠敏感，从而损害其孢子质量。成熟期的长短对芽孢抗性有影响，芽孢杆菌菌株的最佳成熟期为7至21天。本研究结果将为进一步评估消毒剂的杀芽孢活性奠定基础。

2.结果与讨论

本研究中使用的孢子形成培养基和培养条件如表1所示

最佳孢子形成培养基

所有测试的芽孢杆菌属在液体（DSM、2xSG和MAC）培养基中比在固体（TSA和NA）培养基中表现出更强的孢子形成能力。在所有测试的芽孢形成培养基中，DSM是七种测试芽孢杆菌菌株中的四种的首选芽孢形成培养基，包括短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 （ATCC 19659和ATCC 6051）。此外，短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌（ATCC 19659和ATCC 6051）在DSM中表现出最佳的孢子形成能力，孢子形成率约为 90%。稍低的培养温度（30°C）可提高蜡状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的孢子形成水平，相比之下，地衣芽孢杆菌在30°C 时几乎无法产生孢子，它更倾向于在MAC肉汤中形成孢子。在2xSG 中观察到蜡状芽孢杆菌 和苏云金芽孢杆菌的最高孢子形成率（表2）。这些结果表明，不同的芽孢杆菌菌株产生高质量的孢子需要特定的孢子形成液和培养条件。

试验孢子条件判定

在进行杀孢子试验之前，应评估细菌孢子的质量，包括滴度、纯度和对 NaOCl 的抗性。在本研究中，所有经密度离心处理的芽孢杆菌孢子（由各自最佳孢子形成培养基产生）的滴度均可达到约 2-3 × 10⁹ CFU/mL（表 2）。同时，六种受试芽孢杆菌菌株在密度离心和溶菌酶处理、超声处理（表3）或加热处理（图3）后，孢子纯度可达到约90%。苏云金芽孢杆菌的最大孢子纯度约为68.2%。因此，该菌株可能不适合用作芽孢杆菌的代表性测试生物体进行杀孢子试验，因此被排除在我们的进一步研究之外。

为了评估孢子的质量，在孢子抗性试验中，将孢子悬浮液与1500 ppm NaOCl进行不同的接触时间。以5000 ppm NaOCl暴露作为阳性对照，以确认 NaOCl 溶液的有效性。结果表明，无论孢子类型和载体表面类型如何，在5000 ppm NaOCl中接触10 min即可浓度减少5 log以上，而1500 ppm NaOCl 可使浓度减少3 log以下。

因此，芽孢杆菌孢子悬浮液是否符合杀孢子试验的资格，应视为满足以下三个标准：(1) 孢子滴度为 2-3 × 109 CFU/mL；(2) 孢子纯度≥90%；(3) 接触时间为 10 min时，对抗5000 ppm NaOCl，菌浓度减少5 log以上；对抗1500 ppm NaOCl ，菌浓度减少3 log以下。

成熟时间对孢子抗性的影响

对于短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 (ATCC 19659)，在 4℃下储存 7-21 天的孢子对 1500 ppm NaOCl 的抵抗力比对照组 (0天) 更高，菌浓度减少小于3 log。但在4℃下储存28天的孢子对1500 ppm NaOCl敏感，其对数减少量超过3 log，导致这些孢子不符合杀孢子试验的要求。因此，这两种菌株的最佳孢子成熟期应为7至21天。对于蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 (ATCC 6051)的孢子，成熟后未观察到不合格现象。与储存7至21天的孢子相比，储存28天的孢子对1500 ppm NaOCl 的抗性略有下降（图 2）。因此，芽孢杆菌孢子的最佳成熟期可能是4℃下7-21天。

纯化程序对孢子对NaOCl的抗性的影响

将孢子悬浮液在三种温度（65℃、70℃ 或 80℃）的水浴中加热 5、10或20min，然后进行NaOCl抗性测定。地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 (ATCC 6051) 孢子的耐热性相对其他菌株更高，并且没有观察到孢子对 NaOCl 的抗性发生变化（图3），80℃加热 20min是纯化这些菌株孢子的最佳热处理。此外，70℃加热 20 min是纯化蜡状芽孢杆菌孢子的最佳热处理，这可以提高孢子纯度，而不会损害孢子对 NaOCl 的抗性。然而，枯草芽孢杆菌 (ATCC 19659) 孢子在 65℃下处理5 min后对1500 ppm NaOCl 的抵抗力显著降低，这表明热处理不适用于枯草芽孢杆菌 (ATCC 19659) 孢子的纯化。

用浓度为100 μg/mL 的溶菌酶处理短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌(ATCC 6051)孢子后未观察到不合格。为了避免损害孢子的质量，特别是对 1500 ppm NaOCl 的抵抗力，浓度分别为10和1μg/mL 的溶菌酶处理对于纯化蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 (ATCC 19659) 孢子来说是最佳的。

超声处理显著提高了球形芽孢杆菌孢子的纯度，从78.6%提高到95.5%。超声处理后，所有测试的芽孢杆菌孢子在 NaOCl 抗性试验中均未出现不合格情况。

总体而言，在评估和比较芽孢杆菌孢子的传统孢子形成和纯化方法时，我们发现：（i）最佳孢子形成培养基因不同的芽孢杆菌菌株而异；（ii）加热、溶菌酶和超声处理可以提高孢子的纯度，但孢子质量可能会受到影响；（iii）芽孢杆菌菌株的最佳成熟期为7至21天；（iv）建立了孢子质量评估方法的标准，并且在研究中对芽孢杆菌孢子效果良好。所有这些发现为进一步评估消毒剂对芽孢杆菌孢子的杀孢子活性铺平了道路。